1. サンプルボトル開封 

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使用する器具

白衣、マスク、ゴム手袋、キムタオル、洗浄ビン、水道水

0.3mm目合いのニューストンネット、2Lプラスチックビーカー（手付き）、固定用クリップ 、 サンプル保管用ボトル  

＜留意点＞

・海水サンプルの腐敗防止にホルマリンを2％添加しているので、吸入や皮膚等への付着に注意し、白衣、マスク、ゴム手袋を着用する。サンプル原液を取り扱う際は必ずドラフトの下で開封する。ホルマリン廃液は20Lタンクに保管し、適切に処理する。

・当研究室では、約0.3mm～5cmのプラスチック片、発泡スチロール片、プラスチック製の漁網・釣り糸を採集し、各々のサイズごとの個数を集計している。

・作業途中に紛失・破損してしまったものは、計測できなくなるので注意。

＜作業手順＞

① プラスチックビーカー（2L）に0.3ｍｍの目合いのニューストンネットをクリップで固定し、そこへ海水サンプルを流し込む。サンプルボトルの内壁を数回洗い、同様に流し込む。
この時サンプル中に大量の自然由来物がある場合（2Lのサンプルボトルであれば約1/3以上を占めるとき）溢れてしまうことがあるので、必要に応じ数回に分けて作業を行う。
※0.3mm目合いの網目の対角線部分は0.4mmを超えてしまう。そのため、通り抜けた海水には約0.3mm～0.4mmの微細なプラスチックが含まれていることがあるので、後で吸引濾過を行いチェックする。（それまでサンプルボトルに戻し冷蔵保管しておく）

※薬品処理による有機物除去を行う場合はここで「2.薬品処理による有機物除去」 の項へ進む。
 薬品処理を行わない場合は、以下②、③の作業の後、「3. プラスチック採取・ソーティング」の項へ進む。

② ネットに残ったサンプル内容物に洗浄ビンを用い水道水を吹き付け、ホルマリンを洗い流したのち、水道水でプラスチックビーカーに洗いこむ。ネットの表と裏を洗い、残っているものがないようにする。

③ ②を「3. プラスチック採取・ソーティング作業」に供する。すぐに作業しないときはサンプル保管用ボトルに移し冷蔵保管する。この時プラスチックビーカーの内壁もよく洗い、残っているものがないようにする。 
 

注）サンプルが複数ある場合、作業途中で入れ替わったりすることのないよう、作業途中のサンプルボトルや取り出したマイクロプラスチックの保管場所にテープや付箋でサンプル番号を付しておく。

4. 濾過作業

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サンプル開封時に0.3mm目合いのニューストンネットを通り抜けた海水、および取り出し作業終了後受け器に残った液を吸引濾過し、微細なプラスチック片の確認・取り出しを行う。

使用する器具・機器

白衣、マスク、ゴム手袋、洗浄ビン、水道水
吸引濾過器：以下＜＞の器具を組み合わせて作成。

＜フィルターホルダーマニホルド 5連式（AS ONE）、47mmポリサルホンホルダー （ADVANTEC, 型式：KP-47U ）、エアーポンプ（15L/min）、 吸引濾過ビン（500ml）、シリコンチューブ、チューブジョイント、ゴム栓、二方コック＞

2L（または1L）プラスチックビーカー（手付き）、薬さじ、フィルターピンセット、小シャーレ（ろ紙乾燥用）

ろ紙（Whatman, Grade4:粒子保持能20－25μm, CAT No. 1004-047）

黒色ろ紙（ADVANTEC, No.2, 粒子保持能 5μm, 品名：JIS P 3801）

メンブレンフィルター（ADVANTEC, 孔径0.8μm, 素材：mixed cellulose ester、直径47mm, ITEM No. A080P047A, black ）

ルーペ（15×）、小シャーレ（新品）、大シャーレ、先の細いピンセット

廃液タンク(20L)←※廃液タンクは、薬品処理の有無で無機廃液用タンクと有機廃液用タンクを使い分ける。 

＜留意点＞
・作業はドラフト内で行う。白衣・マスク・手袋を着用。
・薬品処理を施したのち取り出し・濾過作業を行ったものに関しては、念のため濾過後の廃液を無機廃液に分類している。またサンプル液が赤褐色に濁っている場合、黒色ろ紙を使うと比較的チェックが容易である。
＜作業手順＞
① 吸引濾過器にろ紙、またはメンブレンフィルターをセットする。
使用するフィルターは、濾過を行うサンプル液の状態により選択する。
（例1）サンプル液が濁っていたり、粘度が高かったりして詰まりやすいと予測される場合は、ろ紙（Whatman, Grade4:粒子保持能20－25μm）を選択。
（例2）取り出し時マイクロプラスチックが多数（2Lサンプルボトル中およそ1000個以上）確認されたサンプルで、かつ含まれる異物（プランクトンや藻など）が少なくサンプル液が透明である場合は、黒色ろ紙（ADVANTEC, No.2, 粒子保持能 5μm）またはメンブレンフィルター（ADVANTEC, 孔径0.8μm）を選択。ただしメンブレンフィルターは非常に詰まりやすいので20～30ml程度から試すと良い。

② サンプル液を2L（または1L）プラスチックビーカーへすべて移す。薬さじでかき混ぜたのち適量（※）のサンプル液を分注し、吸引濾過器接続のポンプのスイッチを入れ、吸引ろ過を行う。
（※）ろ紙１枚ごとに濾過する液量はおよそ30ml～100ml程度。メンブレンフィルター１枚ごとに濾過する液量はおよそ20ml～50ml程度。（詰まらないことが前提であるが、1枚のろ紙に付着する有機物の量が多すぎてろ紙のチェックが困難とならないように前述の通り初めは20～30ml位ずつから試してみて、「液の通りやすさ」・「ろ紙への付着物の量」双方の様子を見ながら決める。）
③ 濾過後、廃液が溜まったらその都度廃液用タンクに排出。廃液の処分は適正に行う。
（薬品処理なし→有機廃液用タンク、薬品処理あり→無機廃液用タンク）

④ 濾過終了後、ろ紙をフィルターピンセットを使って１枚ずつ小シャーレに並べ、室温で一晩乾燥の後、ろ紙上のプラスチック片をルーペで探し(ろ紙全体が見やすいよう大シャ―レに１枚ずつ乗せてチェックする）、新品の小シャーレにピンセットで取り出す。
⑤ ④を撮影・FTIR分析に供する。

注）チェック終了後のろ紙・メンブレンフィルターは産業廃棄物として分類し廃棄すること。

5-2. FTIR分析 (※操作方法は機種により異なるため、基本的な手順のみ記載)

① FTIRを起動する。

② 試料台にサンプルを乗せる前に、 エタノールをしみこませたキムワイプで試料台を拭く。乾いてからバックグラウンド測定を行う。（バックグラウンド測定は分析中も1時間に1回位行う。マイナスピーク出現時や、ベースラインが乱れたときにもその都度行う。）

③ 試料台にサンプルを乗せたらバーを下げ、試料をはさむ。バーの高さを微調整しスペクトルをはっきり表示させる。

④ 測定開始ボタンを押す。スペクトル検索を行いライブラリ中の標準物質と照合を行い（ピークピッキングやシングルピークピックでピーク位置を確認するのも有効）、プラスチックの種類を判別する。海表面で採取したサンプルに含まれるプラスチックは大半がポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンであるが、時折それ以外のプラスチックも出現するのでそのような場合にはスペクトル検索を行う。
注）サンプルに厚みがある場合や、サンプル表面に有機物が付着している場合、うまく材質判定ができないので、カッターでカットしたり表面を拭き取ったりして分析を行う。

⑤ 分析中にサンプルが壊れてしまったら、画像ファイル名に「pl001x」のように最後にxを付ける。分析後にサンプルが小さすぎたり紛失したりして回収できなかった場合は、「pl001xx」のように最後にxxを付ける。
⑥次のサンプルを分析する前にエタノールをしみこませたキムワイプで試料台を拭く。以降③～⑥を繰り返す。

6. サイズ計測と集計

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＜留意点＞
・サイズ計測の前に画像ファイル名に重複や欠番がないか確認を行う。
・プラスチック片が1000個を超える場合、1001番目以降は画像フォルダを別にするとimageJでのサイズ計測の際作業がスムーズとなる。
＜プラスチック片のサイズ計測手順＞
① 撮影終了後、ImageJでサイズを計測する。ImageJを起動し、File→openで計測したい画像ファイルを開いて、左から5番目の直線ツールをクリック（画像C）。マウスのクリック＆ドラッグでプラスチック片の一番長い場所に沿わせ（画像D）、キーボードのMキーで長さを計測する。Mキーを押すと表示される（画像E）表中、右端のピクセル数（Lengthの列の数値）をもとに実際のサイズを求めることができる。
② 次の写真をShift+Oで開き、同様にすべてのサンプルの長さを計測していく。サイズ計測はpl、fb、esそれぞれで行う。

③ サイズを計測し終えたら、ImageJのテーブルをすべて選択（Ctrl+A）し、コピー（Ctrl+C）してExcel集計表（☆Excel集計表はこちらに公開しています。※要注意 1mm当たりのピクセル数を250としたもの。他の換算係数のときは使用できませんので、変更し使用してください。）の所定の位置（O列～U列）にペーストする。Excelの集計表にはpl、fb、esそれぞれに対応するタブがあるので、ペーストする場所に注意する。

④ サンプルのサイズが大きく、PC画面に入りきらなかったものはノギスでサイズを計測し、Excel集計表（D列）に手入力する。
⑤ Excel集計表の「個数」タブにpl、fb、esのサイズ別の個数、総数が表示される。